Die Handlung dreht sich um Kriminaltechniker, auch bekannt als "Crime Scene Investigators" (CSI), die komplexe Mordszenen analysieren, um schwer erreichbare Beweise zu finden. Dazu verwenden sie modernste Technologie und wissenschaftliche Methoden. Dadurch unterscheidet sich "CSI" von traditionellen Krimiserien, in denen der Schwerpunkt häufig auf polizeilichen Befragungen und Verfolgungsjagden liegt.

Die Ermittler arbeiten bei jedem Fall sorgfältig, um die Wahrheit aufzudecken und Gerechtigkeit walten zu lassen. Die Serie zeigt dabei oft die düstere Realität, dass die Ermittler immer zu spät kommen, um die Opfer zu retten, geben aber ihr Bestes, um zumindest für ihre Gerechtigkeit zu sorgen.

Die Hautfiguren in "CSI: Den Tätern auf der Spur" sind Gil Grissom, ein Nachtfährener und wissenschaftlich versierter Chef des Labors, sowie Catherine Willows, eine alleinerziehende Mutter und ehemalige Stripperin, die hart arbeitet, um ihre Karriere voranzutreiben. In späteren Staffeln treten andere wiederkehrende Figuren hinzu, die weitere Facetten des forensischen Prozesses beleuchten.

Die Serie ist bekannt für ihre technischen Details und genaue Darstellung der forensischen Wissenschaft, obwohl sie oft kritisiert wurde, weil sie diese Wissenschaft zu stark dramatisiert und vereinfacht hat.